水蛭是我国传统中药，一千八百年前《神农本草经》中就有记载，中医认为它有破血、 逐瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘤症、痞块、 血瘀、闭经和跌打损伤，西方也常用水蛭素吸 血以治疗某些疾病。从水蛭及其唾液腺中已 提取出多种活性成分，水蛭素是其中活性最 显著并且研究的最多的一种成分，它是由65 一66个氨基酸组成的小分子蛋白质（多肽）。 水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今 为止所发现的最强的凝血酶天然特异抑制 剂。动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效 抗凝血／抗血栓形成以及防止凝血酶催化的 凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现 象，此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细 胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝 素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不 依赖于内源性辅助因子；而肝素由有引起出 血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程 中抗凝血酶往往减少，这将限制肝素的疗效， 采用水蛭素会有较好的效果。
水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药 物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉 血栓和弥漫性血管内凝血的治疗；也可用于 外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解 血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外 血液循环和血液透吸过程，在显微外科手术 中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用 水蛙素可促进伤口愈合。研究表明，水蛭素在 肿瘤治疗中也能发挥作用，它能防止肿瘤细 胞的转移，已证明有效的肿瘤如纤维肉瘤、骨 肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病细 胞等。水蛭素配合化学治疗和放射治疗，由于 促进肿瘤中的血流而增强疗效。
动物性试验和临床研究证明，静脉和皮 下注射水蛙素均无明显副作用，无论急性、亚 急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时 间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也 没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发 现。半致死剂量LD50＞50mg／kg，远大于治 疗所用的剂量（lmg／kg）。此外，水蛭素可以 口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的 某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何服中药水蛙提取液仍然有疗效 的原理。
由于水蛭具有重要开发价值，而水蛭来源有限 故国内外医药界均着重研究通过基因工程取得重 组水蛭素。1986年后，重组水蛭素已在大肠杆菌 和胶木菌中分别表达成功。与天然水蛭素相比， 重组水蛭素在63位氨基酸上未硫酸酯化，活性略化， 其性质基本相同。在治疗的剂量下静脉注射无毒副 反应。现国外一些大的生物技术公司已进入 多方面的临床研究。有关水蛭素类多肽的专 利，每年公布的数量至少在十多项以上，包括 水蛭素类似的多肽、活性水解产物、剂型改 造、生产工艺、检测方法、临床治疗的疾病等， 研究论文每年在数十篇以上。估计不久重组 水螺素类多肽药物将会正式用于临床。 近年来在我国以水蛙为主要成分的中成 药已有多种，如脑血康口服液、抗血栓片、活 血通胶囊，其产值达数千万元。含水蛭的新药 也在不断研究推出。利用基因工程生产重组 水蛭素类多肽药物，以取代水蛭和抗凝化瘀 药的添加成分，这在近期内就可实现。作为注 射剂用于心血管系统疾病和肿瘤治疗药物， 则还需进一步的临床研究。毋庸置疑，重组水 蛭素类多肽药物的研制将会带来巨大的社会 效益和经济效益。
国内外技术发展概况及国内需求 1955年F. Markwawdt首先从水蛭中提 取并纯化得到水蛙素，1970年确定是凝血酶 和特异抑制剂，1984年J．DOdT等测定了水 蛭素氨基酸序列。1986年Dldi等以及另外几 个实验室分别用化学合成的水蛙素基因或克隆的DNA基因在大肠杆菌得到表达。水蛭 素的分子量较小，在宿主细胞内不稳定，产量较低，采用融合蛋白的万法可以提高产量，但 却给后处理带来了麻烦，接上信号肽可以直 接分泌到细胞的周质间隙，1988年6 .Loi. son等利用酵母@因子系统使重组水蛭素表达并分泌到胞外，1989年N. RehL Bellon等 用反相 HPLC分离纯化酵母产生的重组水 蛭素，并对其性质进行了研究，Loison等在酵 母菌中的表达量最高每毫升发酵液可得到 21抗凝血酶单位(ATU)的产物，RehL—BeLlon等每毫升发酵液得到31.8ATU，相当于 酵母菌总蛋白的1％。天然水蛭素的产量太少，限制了对它的研究和应用，通过基因工程 的途径能大量生产水蛭素，从而使它的药理、 临床等方面研究得以广泛深入地开展。 天然水蛭素有多种异构体，其中 Hv1、 HV2和 HV3都有明显的抗凝血酶活性，有些 小肽或环肽活性还超过天然水蛭素。这不仅 为研究抗凝血酶的作用机制提供了理想的模 型，也为设计和研究抗凝血酶的作用机制提 供了重要途径。目前国外不少药物研究机构 正沿着这个方向进行研究。
有关重组水蛭素的分离纯化工艺也有长 足进展。水蛭素分子量较小，在酸性条件下对 热较稳定，利用分子筛柱层析、加热除去杂蛋 白以及阴离于交换层析可以得到初步分离纯 化。水蛭素与凝血酶有极强的亲和力，可被固 定于 Sepharose的凝血酶所吸附，然后再用 竞争剂4一氨基苯甲脒洗脱。多数实验室则 采用反相 HPLC进行纯化。
目前美国、法国、瑞士、德国、日本十多家的生物技术公司和医院正临床研究重组水蛭索 类多胜药物的疗效和药理。中国具有心血管 疾病药物和肿瘤药物的巨大市场，水蛭又是 传统中药，因此比较容易接受水蛭素。首先可 以将水蛭素用来取代药源有限的水蛭，作为 口服药剂用于治疗。经过进一步临床试用后 再作成针剂扩展防治范围，估计短期内可以 达到上亿元的销售额。
国内现有工作基础和条件：生物技术一直是我国优先发展的高技 术。在“六五”、“七五”和“八五”国家科技攻关 计划中均对基因工程药物的研究和生产的研 究打下了良好的基础，有力促进了我国医药 产业的发展，目前已有一批基因工程药物投 放市场。在这一领域内，我国由于广泛使用含 水蛭的中成药，而有十分明显的优势。适当予 以支持，完全有可能领先于世界推出重组水 蛭索类多肢药物。
北京大学生物系是我国最早进行基因工程研究的单位之一，有较强的技术力量和丰 富的研究经济。目前掌握有各种主要的基因 表达系统，已完成多项基因工程和蛋白质工 程的研究。“八五”期间，我们与中医研究院基础所共同承担了攻关专题：水蛭素的生物工 程合成及抗动脉粥样硬化和血栓形成的研 究，北大生物系侧重于水蛭素的基因工程。在此期间我们完成以下几项工作：1、从医用水 蛭头部分离出 mRNA，经逆转录和 PCR得到水睡素的 cDNA，对此 cDNA进行克隆、测序并在大肠杆菌中表达，获得有生物活性的 重组水蛭素。2、化学合成具有大肠杆菌偏爱 密码于的水蛭索 Hv一2基因片段，用递归 PCR扩增，经克隆、测序和在大肠杆菌中得 到高效表达。3、利用不同启动子、SO序列、信 号肤和水蛭素基因构建一系列大肠杆菌分泌 型表达载体，选择适当的宿主菌，比较它们的表 达水平，获得将正确加工产物直接分泌到 培养液中去的高产菌株。4、改进培养条件，提 高基因表达水平，目前我们获得的水蛭素产 率远高于国内外报导的水平，正在做扩大发 酵试验。5、改进和简化产物分离纯化的工艺， 使适合大规模生产。
虽然国内外一些文献认为重组水蛙素极易在大肠杆菌细胞内被蛋白酶水解，酵母是更合宜的表达系统。但我们却认为国外实验室用大肠杆菌表达系统未能得到高产重组水蛭素主要上未掌握关键的因素。与酵母相比,大肠杆菌表达系统比较清楚，好控制，易于提高产量；2、大肠杆菌生长速度比酵母快，培养条件简单3、产品易于分离纯化。目前为提高 产品的产量，大多使基因表达产物在细胞内形成包涵体，这使得产品的后处理变得十分复杂，而且产品经变性后常常不能完全复性而降低产率。我们采用信号肤，使重组水蛭素在穿越质膜过程中进行加工，而且直接分泌 到培养液内，这对生产是极为有利的。北京大学生命科学学院有较好的实验 室条件和仪器设备，院内生命科学中心和蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验室配 置各种大型仪器，对于完成重组水蛭素的研 制和中试可提供必要的条件。
主要技术关键、研究内容及达到的技术经济指标
主要技术关键为：1、在大规模生产条件 下如何维持菌种高产和稳产。根据我们了的 经验，在实验室条件下通过改造表达载体，菌种诱变和控制培养条件，不难将基因表达水 平提高。但是，在扩大生产规模时会遇到很多问题，如噬菌体污染、菌种衰退、产量不稳定 等。因此要尽快进人30—50L的中试，结合中试的问题改造和筛选出可用的菌种。2、根 据生产设备条件，建立和改进高效的、低成本的以及成熟的产品分离纯化工艺。反相H PLC虽然能够有效纯化产物，但不适宜于生产。应根据我们初步摸索的简易纯化方法， 在放规模的条件下进行下游工程的研究。3、在获得足够量纯的重组水蛭素的基础上进行 毒理、药理、药效、药物代谢动力学以及热源、抗过敏反应等一系列动物实验。4、和药厂配合开展临床研究，观察重组水经素在抗凝、化 痰、消栓和配合肿瘤化疗、放疗等方面的疗 效。5、改进重组水蛭素的剂型以增强疗效，寻找更有效的水蛭素类多肽衍生物。